中商情报网讯：全国海洋标准化技术委员会组织相关单位开展了《海绵种属分子鉴定技术规程》（201502007-T）海洋行业标准编制工作，根据《海洋标准化管理办法》要求，现对此项标准征求意见稿公开征求意见。

海绵种属分子鉴定技术规程（征求意见稿）

海绵种属分子鉴定技术规程

1　范围

本标准规定了海绵种属分子生物学鉴定的总则、海绵样品采集与保存、海绵种属分子生物学鉴定方法。

本标准适用于海绵的样品采集、保存、处理和分子生物学种属鉴定方法。

2　规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。      

GB/T 13016-2009  标准体系表编制原则和要求

GB/T 12763.1  海洋调查规范  第1部分：总则

GB/T 12763.6  海洋调查规范  第6部分：海洋生物资源调查

3　术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1  海绵

 海绵是目前仍然生存的最古老、最低等的多细胞动物（Metazoans），在动物界中单独构成多孔动物门（Phylum Porifera）。

3.2  海绵分子条码

海绵的保守基因的（部分）序列，如18s rDNA和细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome oxidase subunit Ⅰ，简称COI）的多氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，简称DNA）序列为海绵的保守基因序列信息，可以作为海绵分子条码。

3.3  海绵骨针

海绵骨针（Spicule）是海绵骨骼的基本组成单元，成分包括由二氧化硅组成的硅质骨针（存在于寻常海绵纲或六放海绵纲中）和由碳酸钙组成的钙质骨针（存在于钙质海绵纲中），是鉴定海绵的重要形态学依据。海绵骨针的形状多样、尺寸相差较大，可作为形态鉴定海绵的指标之一。

4　总则

4.1原理

 海绵的18s DNA和COI DNA序列为海绵的保守基因序列，可以作为海绵分子条码鉴定海绵种属。通过分子生物学技术——聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）分别扩增海绵的18s DNA和COIDNA的部分序列，测序后分别与已经鉴定海绵的18s DNA和COI DNA序列比对，以此鉴定海绵的种属。

海绵中的绝大部分种属由硅质骨针构成骨架，有极少部分海绵种属由钙质骨针构成骨架、而且基本都是深海海绵，因此以生物是否含有骨针区分海绵与其它生物的判据。

4.2仪器与设备

野外生物样品保存箱或泡沫保温箱；

-80℃冰柜；

高速低温冷冻离心机；

聚合酶链式反应DNA扩增仪（简称PCR仪）；

高压灭菌锅；

光学显微镜；

酒精灯。

4.3试剂与材料

 （1）无水乙醇（分析纯）；

 （2）液氮；

 （3）异丙醇（分析纯）；

（4）醋酸钾溶液（60ml 5 mol/L醋酸钾；11.5 ml 冰醋酸；28.5 ml超纯水）；

（5）细胞裂解缓冲液（10 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0；1 mmol/L EDTA，pH 8.0；0.1% SDS）；

 （6）细胞裂解液（20 mmol/L Tris-Cl，pH 7.6）；

（7）蛋白酶K（20 mg/ml）；

（8）TE缓冲液（pH 7.6）（100 mol/L Tris-Cl，pH 7.6；10 mmol/L EDTA，pH 8.0）；

（9）10×PCR缓冲液（500 mmol/L KCl；100 mmol/L Tris-Cl，pH 8.3；15 mmol/L MgCl2，在1.05 kg/cm2 高压灭菌10min）。

 （10）PCR酶；

（11）浓硝酸或浓盐酸；

（12）蒸馏水或去离子水；

（13）吸管；

（14）载玻片。

5　海绵样品采集与保存

5.1 对于潮间带海绵，先拍照或摄像，再用金属或木质的小板采集海绵样品于塑料采样瓶中，立刻加入无水乙醇浸没海绵样品并超过2 cm以上，然后放入装有冰袋的泡沫保温箱或野外生物样品保存箱，用于分子生物学鉴定。

5.2 对于潮下带海绵和深海海绵，采样器采集海绵后放入塑料采样瓶中并在瓶中装满样品附近的海水。装有海绵样品和海水的样品瓶被带上船或带上岸后，倒掉采样瓶中海水，立刻加入无水乙醇浸没海绵样品并超过2 cm以上，然后放入装有冰袋的泡沫保温箱或野外样品保存箱，用于分子生物学鉴定。

5.3 上述样品均可在4℃条件下保存1天。

5.4 上述样品转移至-20℃保存。在-20℃保存约2周时间，需要更换全部无水乙醇，无水乙醇加入量超过2 cm以上，然后继续放在-20℃保存。在-20℃继续保存约3个月，需要更换全部无水乙醇，无水乙醇加入量超过2 cm以上，然后继续放在-20℃保存。由此，可以在-20℃继续保存1年。

5.5 海绵样品采集与保存记录于《海绵资源调查采样表》（详见附录A）。